Üstün Özellikli Bazı Antepfıstığı Anaç Genotiplerinin Yeni Nesil Biyoreaktör Sistemleriyle Klonal Olarak Çoğaltılması için İn Vitro Protokol Geliştirilmesi

TÜBİTAK Projesi, 2218 - Yurt İçi Doktora Sonrası Araştırma Burs Programı, 2024 - 2026

Proje Türü: TÜBİTAK Projesi
Destek Programı: 2218 - Yurt İçi Doktora Sonrası Araştırma Burs Programı
Başlama Tarihi: Mayıs 2024
Bitiş Tarihi: Mayıs 2026

Proje Özeti

Pistacia L. (Anacardiaceae) cinsi, başlıca Akdeniz Havzası ve Orta Asya’da yayılış gösteren en az 11 türü kapsamaktadır (Zohary, 1952). Bu türler arasında yer alan Pistacia vera L. (antepfıstığı), dünya genelinde ekonomik değeri yüksek olan önemli sert kabuklu meyve türlerinden biridir (Al-Saghir ve Porter, 2012; Acar vd., 2017; Temunović vd., 2024). Türkiye’de antepfıstığı yetiştiriciliği bin yılı aşkın bir geçmişe sahip olup, ülke aynı zamanda dünyanın en zengin Pistacia genetik kaynaklarından birine ev sahipliği yapmaktadır (Kaska, 1990). Uygun ekolojik koşulları ve yüksek genetik çeşitliliği sayesinde Türkiye, İran ve Amerika Birleşik Devletleri ile birlikte dünya antepfıstığı üretiminde önde gelen ülkeler arasında yer almaktadır (Pakyürek vd., 2022). Bu genetik çeşitlilik içerisinde yer alan Pistacia palaestina ve Pistacia terebinthus gibi yabani türler, özellikle abiyotik streslere dayanıklılıkları nedeniyle önemli anaç adayları olarak değerlendirilmektedir (Acar, 2020; Akbari vd., 2024). Pistacia türlerinin ekonomik önemine ve genetik zenginliğine rağmen, bu türlerin klonal olarak çoğaltılması teknik açıdan oldukça güçtür. Odunsu bitki özelliği gösteren bu türlerde düşük adventif köklenme kapasitesi, yüksek fenolik bileşik salınımı ve endojen mikrobiyal kontaminasyon gibi faktörler in vitro kültür başarısını önemli ölçüde sınırlandırmaktadır (Kovalchuk vd., 2018; Hameg vd., 2020). Bu sınırlamalar içerisinde yüzey sterilizasyonu, kültürün başarısını doğrudan etkileyen en kritik aşamalardan biri olarak öne çıkmaktadır. Bu türlerde mikroorganizmaların elimine edilmesi ile bitki dokusunun canlılığının korunması arasındaki denge oldukça hassastır. Yüksek konsantrasyonlu sterilizasyon ajanları kontaminasyonu azaltmada etkili olsa da çoğu zaman doku nekrozu ve büyüme geriliğine yol açmaktadır. Bu amaçla sodyum hipoklorit, hidrojen peroksit, gümüş nitrat ve cıva klorür gibi farklı dezenfektanlar odunsu bitkilerde yaygın olarak kullanılmaktadır (Leifert ve Cassells, 2001; Bacchetta vd., 2008; İslam ve Bilir Ekbiç, 2020). Ancak yüksek toksisite ve çevresel riskler nedeniyle cıva klorürün kullanımı sınırlı kalmakta, buna karşılık daha düşük fitotoksisiteye sahip olması nedeniyle sodyum hipoklorit (çamaşır suyu) uygulamaları daha yaygın tercih edilmektedir (Tambarussi vd., 2015). Pistacia türlerinde in vitro çoğaltım çalışmalarının en önemli sınırlayıcı faktörlerinden biri, genotipler arasında gözlenen belirgin farklılıklardır. Aynı tür içerisinde yer alan genotiplerin doku kültürü koşullarına verdikleri yanıtların değişkenlik göstermesi, evrensel ve yüksek verimli bir çoğaltım protokolü geliştirilmesini güçleştirmektedir. Nitekim farklı besi ortamları (MS, DKW, WPM) ve bitki büyüme düzenleyici kombinasyonları ile uzun yıllardır yürütülen çalışmalara (Abousalim ve Mantell, 1992; Parfitt ve Almehdi, 1994; Dolcet-Sanjuan ve Claveria, 1995; Al-Safadi ve Elias, 2010; Aghaei vd., 2013; Akdemir vd., 2013; Lambardi vd., 2015; Tilkat vd., 2023) rağmen düşük çoğalma kapasitesi, fenolik oksidasyon ve yüksek kontaminasyon oranları gibi sorunlar devam etmektedir. Özellikle mikroçoğaltım ve köklenme aşamalarında farklı hormon kombinasyonlarının önerilmiş olması, sistemin genotip bağımlı yapısını açıkça ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, klasik katı kültür sistemlerinin yüksek maliyetli ve sınırlı çoğaltım kapasitesine sahip olması, biyoreaktör gibi sıvı kültür sistemlerini alternatif bir yaklaşım olarak öne çıkarmaktadır. Ancak bu sistemlerde de hiperhidrisite gibi fizyolojik sorunlar önemli bir sınırlayıcı unsur olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu çerçevede, Pistacia türlerinde klonal anaç üretiminin sürdürülebilir şekilde sağlanabilmesi için genotip spesifik mikroçoğaltım stratejilerinin geliştirilmesi ve biyoteknolojik üretim sistemlerinin optimize edilmesi gerekmektedir. Geçici daldırma prensibine dayalı biyoreaktör sistemleri katı kültür ortamlarına kıyasla otomasyon imkânı, aynı anda daha fazla eksplant ile çalışma olanağı ve jelleştirici kullanımını ortadan kaldırması gibi önemli avantajlar sunmaktadır. Bu çalışmada, klasik katı Bu çalışma, farklı genotiplerin in vitro yanıtlarını karşılaştırmalı olarak değerlendirmek, uygun sterilizasyon ve çoğaltım koşullarını belirlemek ve elde edilen verileri ileri analiz yöntemleri ile modelleyerek sistemin daha kapsamlı şekilde anlaşılmasına katkı sağlamak amacıyla yürütülmüştür. Öte yandan, son yıllarda veri bilimi alanında yaşanan gelişmeler, makine öğrenmesi yöntemlerinin tarımsal ve biyoteknolojik araştırmalarda etkin bir şekilde kullanılmasını mümkün kılmıştır. Makine öğrenmesi algoritmaları, deneysel değişkenler arasındaki karmaşık ve doğrusal olmayan ilişkileri ortaya koyabilmekte ve sistemlerin öngörülebilirliğini artırmaktadır (Niazian ve Niedbała, 2020; Hesami vd., 2022; Kumari vd., 2025). Bu yöntemler, özellikle doku kültürü gibi çok faktörlü sistemlerde başarıyı belirleyen kritik parametrelerin belirlenmesinde önemli avantajlar sunmaktadır. Ancak Pistacia türlerinde yapılan doku kültürü çalışmalarında, makine öğrenmesi yaklaşımlarının klasik istatistiksel analizlerle birlikte kullanımı oldukça sınırlıdır. Bu doğrultuda, Pistacia anaçlarının in vitro ortamda başarılı bir şekilde tesis edilebilmesi için sterilizasyon protokollerinin genotip bazlı olarak optimize edilmesi gerekmektedir. Bu araştırmada, yüksek aşı uyumu gösterdiği belirlenmiş olan 63-PP-08 (P. palaestina) ve 63-PT-09 (P. terebinthus) genotipleri kullanılmıştır. Çalışmanın temel amacı, bu genotiplerin in vitro koşullarda çoğaltılabilmesi için uygun sterilizasyon ve mikroçoğaltım protokollerinin geliştirilmesi ve erken dönem büyüme parametrelerinin detaylı olarak değerlendirilmesidir. Bu kapsamda, elde edilen sürgün materyalinin biyoreaktör sistemine aktarılabilirliği ve bu sistemde gözlenebilecek fizyolojik tepkiler (özellikle hiperhidrisite) dikkate alınmıştır.Geçici daldırma prensibine dayalı biyoreaktör sistemleri katı kültür ortamlarına kıyasla otomasyon imkânı, aynı anda daha fazla eksplant ile çalışma olanağı ve jelleştirici kullanımını ortadan kaldırması gibi önemli avantajlar sunmaktadır. Bu çalışmada, klasik katı kültür sistemlerine alternatif olarak biyoreaktör temelli sıvı kültür sistemlerinin Pistacia anaç genotiplerinin çoğaltımındaki uygulanabilirliği değerlendirilmiştir. Bu amaçla, in vitro koşullarda elde edilen sürgün uçları ve nodal segmentler biyoreaktör sistemine aktarılabilecek materyal olarak değerlendirilmiş ve farklı daldırma süreleri ile frekanslarının olası etkileri literatür bilgileri doğrultusunda göz önünde bulundurulmuştur. Literatürde, kısa aralıklarla yapılan daldırma uygulamalarının eksplantlarda hiperhidrisite oranını önemli ölçüde artırdığı, buna karşılık daha uzun aralıklarla gerçekleştirilen daldırmaların bu problemi azalttığı bildirilmiştir. Nitekim özellikle 10 dakika süreyle ve 16 saatlik aralıklarla yapılan daldırmaların, sürgün oluşum kapasitesini artırırken hiperhidrisiteyi minimize ettiği belirtilmektedir (Tilkat vd., 2014). Bu çalışma kapsamında elde edilen bulgular, biyoreaktör sistemlerinin teorik olarak yüksek çoğaltım potansiyeline sahip olduğunu desteklemekle birlikte, genotipler arası farklılıkların bu sistemlere geçişte belirleyici olduğunu göstermiştir. Özellikle 63-PT-09 genotipinde yeterli ve homojen sürgün materyali elde edilememesi nedeniyle biyoreaktör aşamasına geçiş sağlanamazken, 63-PP-08 genotipinde sınırlı düzeyde de olsa biyoreaktör uygulamaları için uygun materyal elde edilebilmiştir. Bununla birlikte, sıvı kültür koşullarında hiperhidrisite oluşumu gözlenmiş ve bu durum sürgün kalitesini olumsuz etkilemiştir. Bu sonuçlar, Pistacia türlerinde biyoreaktör sistemlerinin etkin şekilde kullanılabilmesi için yalnızca sistem parametrelerinin değil, aynı zamanda genotip ve başlangıç materyalinin kalitesinin de optimize edilmesi gerektiğini ortaya koymaktadır. Çalışmanın ikinci önemli amacı ise, elde edilen deneysel verilerin makine öğrenmesi algoritmaları ile analiz edilerek kontaminasyon oranı, yaşama oranı ve morfolojik gelişim parametrelerinin tahmin edilebilirliğinin ortaya konulmasıdır. Bu sayede genotip, sterilizasyon tipi ve konsantrasyon gibi değişkenler arasındaki ilişkilerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılması hedeflenmiştir. Sonuç olarak bu çalışma, Pistacia türlerinde in vitro çoğaltım sistemlerinin geliştirilmesine katkı sağlamanın yanı sıra, biyoreaktör destekli çoğaltım yaklaşımlarının değerlendirilmesi ve biyoteknolojik üretim süreçlerinin veri temelli yöntemlerle optimize edilmesine yönelik önemli bir bilimsel altyapı sunmaktadır.