Termofilik Anoxybacillus flavithermus ptps Geninin Ekspresyonu ve Gen Ürününün Biyokimyasal Karakterizasyonu


BERİŞ F. Ş. , Akyıldız E., KARAOĞLU H. , AKYÜZ TURUMTAY E. , Girgin G., Baydar T.

Ulusal Moleküler Biyoloji ve Biyoteknoloji Kongresi, Afyon, Türkiye, 21 - 24 Ağustos 2015, cilt.1, no.1, ss.112

  • Cilt numarası: 1
  • Basıldığı Şehir: Afyon
  • Basıldığı Ülke: Türkiye
  • Sayfa Sayıları: ss.112

Özet

Fenilketonüre (FKU) veya hiperfenilalanemia (HPA), kalıtsal metabolik bir hastalık olup primer ortaya çıkış nedenlerinden biri tetrahidrobiopterin (BH4) biyosentez mekanizmasından sorumlu olan gchI, ptps ve spr genlerinde bozukluklardır. PTPS, dihidroneopterin trifosfatı 6-pirovoil tetrahidropterine dönüştürür. BH4’ün
kimyasal olarak sentezlenmesi oldukça zordur ve karmaşık prosedürlerin kullanımını gerekli kılar. Bu nedenle, BH4 biyosentez yolunda görevli olan genlerin rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak mikroorganizmalarca üretiminin sağlanması kimyasal senteze alternatif olabilir. Çalışmamızda, termofilik Anoxybacillus flavithermus
bakterisine ait 438 nükleotilik ptps geni, NCBI Gen Bank verilerinden elde edilen dejenere primerler kullanılarak PZR ile elde edildikten sonra pET28a(+) ekspresyon vektörüne klonlandı ve E. coli BL21(DE3)pLysS hücresine aktarıldı. 37?C’de 4 saat boyunca IPTG indüksiyonu yapılarak gen ekspresyonu sağlandı. Gen ürünü olan PTPS,
ısı şoku ve Ni-NTA saflaştırma kolonu ile saflaştırıldı. Enzimin optimum pH 8,8’de, optimum sıcaklığının 65?C’de olduğu belirlendi. Enzim aktivitesi, doğal metabolik substratı olan 7,8-dihidro-D-neopterin-3’-trifosfatın 6-piruvoiltetrahidropterine dönüşümü ile ayrıca sepiapterinin 7,8-dihidroneopterine dönüşüm reaksiyonları ile
belirlendi. Enzimin sepiapterini 7,8-dihidroneopterine dönüştürme yeteneğinin olmadığı görüldü. Doğal substartı ile yapılan biyokimyasal karakterizasyonlar devam etmektedir. Bu çalışma TÜBİTAK 113Z811 nolu proje ile desteklenmektedir.

PKU or HPA are congenital disorders due either to mutated enzyme protein such as (GTP cyclohydrolase I, GCHI, 6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase, PTPS, and sepiapterin reductase, SPR) or to a deficiency of its obligatory cofactor tetrahydrobiopterin (BH4). PTPS catalyzes the second step of tetrahydrobiopterin (BH4) synthesis and converts dihydroneopterin triphosphate to 6-pyrovoyl tetrahydropterin. The chemical synthesis of BH4 is difficult. It requires expensive materials, uses many synthetic steps, and requires complicated handling procedures. This makes it a good target for the development of alternate production methods with using responsible genes in microorganisims with recombinant DNA technologies. In this study, ptps gene from thermophilic Anoxybacillus flavithermus, was cloned into an expression vector, pET28a(+) and introduced in E. coli BL21(DE3)pLysS host cells. Gene expression was achieved by IPTG induction at 37?C. PTPS was purified by heat schock and Ni-NTA
affinity chromatography techniques. We determined the optimum pH and temperature of the enzyme are 8.8 and 65?C, respectively. To biochemical characterization of the enzyme, we have used two substrate, 7,8-d,hydroneopterin triphosohate as metabolic substrate, and sepiapterine. PTPS cannot convert sepiapterin to 7,8-dihydroneopterine. Other biochemical studies with metabolic substrate were continued. This study was supported by TUBITAK (Project No. 113Z811).