Termofilik Anoxybacillus flavithermus Bakterisine ait B -glukosidaz Geninin Klonlanması, Ekspresyonu ve Enzim Karakterizasyonu


BERİŞ F. Ş. , Uzun A., Akyıldız E., SANDALLI C., KARAOĞLU H.

Ulusal Moleküler Biyoloji ve Biyoteknoloji Kongresi, Afyon, Türkiye, 21 - 24 Ağustos 2015, cilt.1, sa.1, ss.5

  • Yayın Türü: Bildiri / Tam Metin Bildiri
  • Cilt numarası: 1
  • Basıldığı Şehir: Afyon
  • Basıldığı Ülke: Türkiye
  • Sayfa Sayıları: ss.5

Özet

Dünyada bol bulunan ve yenilenebilir enerji kaynağı olan selülozun yıkımında da rol oynayan enzimlerden biri olan ? -glukosidazlar (3.2.1.21), oligosakkaritlerin yapısında bulunan β-glukozidik bağların hidrolizinden sorumludur. Ayrıca çözünür sellobiyoz ve sello-oligosakkaritleri glukoz birimlerine hidrolizlerler. Özellikle termofilik karakterde olan ?-glukosidazlar yüksek sıcaklıkta çalışmalarından dolayı endüstriyel olarak birçok
avantaja sahiptirler. Bu çalışmada, termofilik Anoxybacillus flavithermus bakterisine ait ?-glukosidaz geni PZR ile saptanarak klonlanmış ve E. coli’de eksprese edilerek biyokimyasal karakterizasyonu amaçlanmıştır. Afbgl geni PZR ile yakalanarak pET100 Directional TOPO Expression kit ile E. coli BL21Star(DE3) hücresinde ekprese
edilmiştir. Sonrasında ısı çöktürmesi ve Ni+2 afinite kromatografisi yöntemleriyle saflaştırılmıştır. SDS-PAGE analizinde enzimin 52 kDa olduğu, optimum çalışma sıcaklığının 65?C, optimum pH’sı 6,8 olarak bulunmuştur. Enzimin substratı olan p-nitrofenil ? -D-glukosid ile yapılan kinetik denemelerde Vmax değerinin 44,55 U, Km
değerinin ise 402,9 μM olduğu belirlenmiştir. Metal iyonlarının enzim aktivitesine etkisinde BRENDA verilerine göre seçilen K+, Cu+2, Mg+2, Mn+2, Zn+2, Al+3, Fe+3 iyonları kullanıldı. Kullanılan tüm metallerin 0,1 mM’dan itibaren aktiviteyi inhibe ettiği sadece Mg+2’nin 0,5 mM konsantrasyonda aktiviteyi 1,6 kat arttırdığı bulundu.
Enzim üzerine EtOH, DTT, EDTA, 2-propanol, 2-bütanol, β-ME, TritonX-100 etkileri incelendi. Genel olarak tüm kimyasalların aktiviteyi inhibe ettiği görüldü. Çalışmada ayrıca 4-nitrofenil-β-D-sellobiozid, 2-nitrofenil-β-D-galaktopiranozid, 4-nitrofenil-β-D-ksilopiranozid, D-salisin, D-(+)-sellobioz sentetik ve doğal substratlar olarak kullanıldı. Bu substratların Vmax ve Km değerleri hesaplanmaktadır.

? -glucosidases (3.2.1.21) hydrolyse cellulose which is the most abundant and renewable source of energy on Earth. Also this enzyme completes the hydrolysis by converting cellobiose and cello-oligosaccharides into glucose monomers. Expecially, thermophilic ? -glucosidases from thermophilic microorganisms allow the enzyme reaction at high temperature that make several advantages for industrial usages. In this study, we aimed to clone, expression, and biochemical characterization of thermophilic ?-glucosidase gene from thermophilic bacterium, Anoxybacillus flavithermus. The gene was cloned, sequenced, and expressed in E. coli. The gene, Afbgl, consists 1383 bp of
nucleotides and encoded a polypeptide of 461 amino acids. Afbgl was cloned and overexpressed in E. coli BL21Star(DE3) host cells with pET100 Directional TOPO Expression Kit. Then, we purified to homogenity by heat precipitation and Ni+2-affinity chromatography. The molecular mass of the recombinant enzyme was 52 kDa.
The optimum temperature and pH of the purified enzyme were 65?C and 6,8, respectively. At these points, the enzyme had 44,55 U/mL of Vmax and 402,9 μM of Km towards p-nitrophenyl ? -D-glucoside. We had been tested some metal ions as BRENDA data, K+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Al3+, Fe3+. Our results show all metal we tested are inhibitor. We also tested some chemical to determine how to effect on enzyme activity, i.e. EtOH, DTT, EDTA, 2-propanol, 2-butanol, β-mercaptoethanol, and TritonX-100. All tested chemicals were inhibited the activity with the lowest concentrations. Our studies continious to determinig the activity with different substrates, 4-nitrophenyl-β-D-cellobioside, 2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, 4-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, Dsalicin, and D-(+)-cellobiose.