Tümör baskılayıcı protein 53'ün (p53) transaktivasyon domainindeki (TAD) Ser15'in ataksi-telenjiektazi mutasyonlu (ATM) kinaz tarafından fosforilasyonu, p53'ün tümör baskılayıcı işlevinde çok önemli bir adımdır. Ser15 fosforilasyon oranını etkileyen faktörlerin anlaşılması, kanser tedavisinde ATM-p53 yolağının manipülasyonu için yeni stratejiler sağlayabilir. Bu çalışmada, ATM ve p53 arasındaki elektrostatik etkileşimlerin etkisi, Ser15'in 5 ila 9 arasında değişen pH aralıklarında fosforilasyonu ölçülerek araştırılmıştır. Bunu başarmak için iki farklı kinaz tahlil yöntemi kullanılmıştır: fosforile Ser15'i doğrudan ölçen ELISA tekniği ve ADP oluşumunu değerlendiren Universal Kinase Assay. Sonuçlar, Ser15 fosforilasyonunun pH'a bağlı olduğunu ve alkali aralıkta daha yüksek fosforilasyon oranlarının gözlendiğini ortaya koymuştur. Asidik pH'da gözlenen daha düşük fosforilasyon oranlarının protein denatürasyonundan kaynaklanıp kaynaklanmadığını tespit etmek için CamSol sunucusu kullanılarak pH'ya bağlı bir çözünürlük profili oluşturulmuştur. Elde edilen sonuçlar, gerçekleştirilen kinaz deneylerinin pH aralığı içinde karşılaştırılabilir çözünürlük oranları göstermiştir. Ayrıca, TAD1-39'daki negatif yüklü kalıntıların önemi, ChimeraX kullanılarak TAD1-39'daki Asp ve Glu kalıntılarının hidrofobik ve yüksüz hidrofilik kalıntılarla değiştirilmesi ve ardından protein-protein yerleştirme sunucusu HADDOCK2.4 kullanılarak ATM ile etkileşimlerinin karşılaştırılmasıyla değerlendirilmiştir. Yerleştirme simülasyonlarının sonuçları, negatif yüklü kalıntıların yüksüz olanlarla değiştirilmesinin ATM ve TAD1-39 arasındaki etkileşimin etkinliğinde bir azalmaya yol açtığını göstermiştir. Sonuç olarak, ATM ve TAD arasındaki elektrostatik etkileşimlerin optimal Ser15 fosforilasyonu için önemli olduğu söylenebilir.
The phosphorylation of Ser15 in the transactivation domain (TAD) of the tumor suppressor protein 53 (p53) by ataxia-telangiectasia mutated (ATM) kinase is a crucial step in the tumor suppressor function of p53. An understanding of the factors that affect the rate of Ser15 phosphorylation may provide new strategies for the manipulation of the ATM-p53 pathway in cancer therapy. In this study, the effect of electrostatic interactions between ATM and p53 was investigated by measuring the phosphorylation of Ser15 at varying pH ranges from 5 to 9. To achieve this, two different kinase assay methods were utilized: the ELISA technique, which directly quantifies the phosphorylated Ser15, and the Universal Kinase Assay, which assesses the formation of ADP. The results revealed that Ser15 phosphorylation was pH-dependent, with higher phosphorylation rates observed in the alkaline range. To ascertain whether the lower phosphorylation rates observed at acidic pH were due to protein denaturation, a pH-dependent solubility profile was generated using the CamSol server. The obtained results demonstrated comparable solubility rates within the pH range of the kinase assays performed. Furthermore, the significance of negatively charged residues in TAD1-39 was evaluated by substituting Asp and Glu residues with hydrophobic and uncharged hydrophilic residues in TAD1-39 using ChimeraX and subsequently comparing their interactions with the ATM using the protein-protein docking server HADDOCK2.4. The results of the docking simulations indicated that the alteration of negatively charged residues with uncharged ones resulted in a reduction in the efficiency of the interaction between the ATM and TAD1-39. In conclusion, it can be stated that electrostatic interactions between the ATM and TAD are important for optimal Ser15 phosphorylation.
