Termofilik Anoxybacillus flavithermus DSM 2641T bakterisinin ptps geninin klonlanması, ekspresyonu ve enzimin biyokimyasal karakterizasyonu
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji (Yl), Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2018
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: Efsun ÇELİK
Danışman: Fatih Şaban Beriş
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Fenilketonüri (FKÜ), yenidoğan bebeklerde fenilalanin hidroksilaz enzim yetersizliğinden kaynaklanan ve tedavi edilebilir zekâ geriliklerinin en önemli nedeni olan bir hastalıktır. Hastalığın nedenlerinden biri de, bu metabolik yolakta yer alan PTPS enzimine ait kusurlardan ileri gelir. Hastalığın tedavisi mümkün olmayıp, kronik hastalarda ömür boyu tetrahidrobiopterin yüklemesi yapılmaktadır. Günümüzde tetrahidrobiopterin maddesi kimyasal olarak sentezlenmektedir. Kimyasal sentezin uzun sürmesi, masraflı olması ve de kimyasal kirleticilere maruz kalması nedeniyle biyolojik olarak üretim farklı bir bakış açısıdır. Bu nedenle, termofilik Anoxybacillus flavithermus DSM 2641T bakterisine ait ptps geni PZR yöntemiyle tespit edildi ve pET28a(+) ekspresyon vektörüne klonlandı. E. coli BL21(DE3)pLys konak hücresinde gerçekleştirilen ekspresyon sonrasında Ni-NTA afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Enzime ait biyokimyasal ve kinetik parametreler, ters faz HPLC sistemi ile belirlendi. Yapılan çalışmalar sonucunda 438 bç'lik genin, 145 amino asitlik 17 kDa büyüklüğünde bir enzimi ürettiği görüldü. Enzimin optimum pH'sı 8,8, optimum çalışma sıcaklığı ise 65C olarak belirlendi. Sepiapterin dönüşüm aktivitesi bulunmayan enzimin, NTP-H2 aktivitesinde ise maksimum hızı (Vmax) 0,0081 ± 0,00017 μmol/dak/mg protein ve Km'si ise 0,261 ± 0,007 mM olarak belirlendi. Yapılan çalışmalarda 5 mM K+'un % 9, 10 mM Ca+2'nin % 5 oranında aktiviteyi arttırdığı, 1, 5, 10 mM Al+3'ün % 2, 1 mM Zn+2'nin % 5,5 oranında, 5 mM DTT'nin ise % 50 inhibe ettiği bulundu.